Изменето од Питер Сарноу, Медицинскиот факултет на Универзитетот Стенфорд, Универзитетот Стенфорд, Калифорнија, одобрено на 25 декември 2020 година (прегледано на 25 октомври 2020 година)
Ја известуваме интеракцијата помеѓу подединици во репликацијата на коронавируси-транскрипциони комплекси, кои се од суштинско значење за репликација и еволутивна конзервација.Дадовме докази дека доменот NiRAN поврзан со nsp12 има активност на нуклеозид монофосфат (NMP) трансфераза во транс, и го идентификувавме nsp9 (протеин што врзува РНК) како негова цел.NiRAN го катализира ковалентното прицврстување на делот NMP на конзервираниот nsp9 амино крај во реакција која се потпира на јони Mn2+ и соседните конзервирани остатоци од Asn.Утврдено е дека активноста на NiRAN и nsp9 NMPylation се неопходни за репликација на коронавирусот.Податоците ни овозможуваат да ја поврземе оваа активност на вгнездениот вирусен ензимски маркер со претходните набљудувања во хипотезата дека иницирањето на синтезата на РНК во класа на РНК вируси е функционално и еволутивно конзистентно.
РНК-зависната РНК полимераза (RdRps) на Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae и 12 други семејства) е поврзана со амино-терминалниот (N-терминален) домен во неструктурниот протеин (nsp) ослободен од полипротеинот, наречен NiRAN 1ab е составен од вирусна главна протеаза (Mpro).Претходно, беше пријавена активност на сопствената GMPylation/UMPylation на артерискиот вирус NiRAN-RdRp nsp и беше предложено да се генерира транзиторна состојба за трансфер на нуклеозид монофосфат (NMP) до (тековно непознати) вируси и/или клеточни работи за биополимеризација.Овде, покажуваме дека коронавирусот (Human Coronavirus [HCoV]-229E и Тежок акутен респираторен синдром Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) има NMPylation активност зависна од Mn2+, која е изведена од nsp9 преку формирање на Mpro-посредувана nsp9 По N-терминалниот крилен nsps протеолитички се ослободува, фосфорамидатот е врзан за примарниот амин (N3825) на N-терминалот на nsp9.Уридин трифосфат е префериран нуклеотид во оваа реакција, но аденозин трифосфат, гванозин трифосфат и цитидин трифосфат се исто така соодветни косупстрати.Студиите за мутации со користење на рекомбинантни протеини на коронавирус nsp9 и nsp12 и генетски конструирани HCoV-229E мутанти ги утврдија остатоците неопходни за NiRAN-посредувана nsp9 NMPylation и репликација на вирусот во клеточна култура.Податоците го потврдија предвидувањето на остатоците од активното место на NiRAN и ја утврдија важната улога на остатоците од nsp9 N3826 во nsp9 NMPилацијата и репликацијата на вирусот ин витро.Овој остаток е дел од зачуваната N-терминална NNE трипептидна секвенца и се покажа како единствениот непроменлив остаток на nsp9 и неговите хомологи во семејството на коронавирус.Оваа студија обезбедува солидна основа за функционална студија на активноста на NMPylation на други вгнездени вируси и предлага можни цели за развој на антивирусни лекови.
Nidovirales позитивно-верижен РНК вирус инфицира различни 'рбетници и без'рбетници (1, 2).Редот моментално вклучува 14 семејства (3), од кои семејството на коронавирус е интензивно проучувано во изминатите 20 години.Во тоа време, три зоонозни коронавируси се појавија од животински домаќини и предизвикаа големи епидемии на тешки респираторни инфекции кај луѓето.Вклучувајќи ги и постојаните пандемии предизвикани од тешки акутни заразни болести.Респираторен синдром Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).Нидовирусите имаат заедничка организација на геномот, а подединицата на комплексот за репликација-транскрипција врзан за мембрана (RTC) е кодирана во 5-?²-терминалните две третини и главната структурна подединица на честичката на вирусот, како и некои додатоци .Протеин, кодиран во 3??² крајната третина од геномот (1).Освен една фамилија на планарни вируси (Monoviridae) (8), сите вгнездени вируси кодираат RTC подединици во две големи отворени рамки за читање (ORF) ORF1a и ORF1b, кои се преведени од геномската РНК на.ORF1a го кодира полипротеинот (pp) 1a, а ORF1a и ORF1b заеднички го кодираат pp1ab.Со општо учество на главната протеаза (Mpro) кодирана од ORF1a, и pp1a и pp1ab се протеолитички обработени во различни неструктурни протеини (nsps), исто така познати како 3CLpro, бидејќи има хомологија со 3Cpro на пикорнавирусот ( 9).Се смета дека овие nsps се составени во голем динамичен RTC, ја катализираат синтезата на геномната РНК (репликација) и збир на субгеномска РНК (транскрипција) и се користат за координирање на експресијата на ORF лоцирана низводно од ORF1b (10??? ?12).
Основниот RTC вклучува РНК-зависна РНК полимераза (RdRp) (13), суперфамилија 1 хеликаза (HEL1) (14, 15) и неколку ензими за обработка на РНК, кои главно се кодирани во ORF1b и во семејството на коронавирус. Таа содржи nsp12-nsp16 и nsp9-nsp12 во семејството Arterioviridae (види референца 10ââ 12).RdRp и HEL1 претставуваат два (една петтина) конзервирани домени на вирусот на птичјото гнездо и имаат хомологија меѓу другите РНК вируси.Се верува дека основната реплика е потпомогната од други подединици, вклучувајќи неколку мали nsps ослободени од карбокси-терминалниот (C-терминален) регион на pp1a, низводно од Mpro (коронавирус nsp5 и артериски вирус nsp4, соодветно).Тие имаат ограничена заштита специфична за семејството и разновидни активности (прегледани во референцата 10ââ12).
Релативно неодамна, домен со уникатни карактеристики на мотивот на секвенцата беше пронајден на амино терминалот (N-терминал) во непосредна близина на RdRp кај сите вгнездени вируси, но нема други РНК вируси (16).Врз основа на неговата локација и активноста на нуклеотидната трансфераза (нуклеозид монофосфат [NMP] трансфераза), овој домен е наречен NiRAN (Nestvirus RdRp-поврзана нуклеотидна трансфераза).Комбинацијата со двоен домен на NiRAN-RdRp го сочинува nsp12 во семејството Coronaviridae и nsp9 во семејството Arterioviridae, а кај другите нестовириди, NiRAN-RdRp се очекува да се ослободи како независен nsp од вирусниот полипротеин.Во коронавирусот, доменот NiRAN содржи ??1/450 остатоци и е поврзан со C-терминалниот RdRp домен преку поврзувачкиот регион (16?19).Во Вирус на коњски артеритис (EAV) (Arteriviridae), рекомбинантниот nsp9 покажува Mn2+ јонски зависни (само) UMPylation и GMPylation активности, кои зависат од три зачувани бази на секвенци во нестовирусот, AN, BN и CN остатоците во низата.Каде што N значи NiRAN) (16).N-терминалното крило на овие мотиви е помалку конзервативен мотив preAN.Некои од овие остатоци се исто така конзервирани во далечно поврзани протеински кинази, каде што се покажа дека се вклучени во врзувањето на нуклеозид трифосфат (NTP) и каталитичката активност (20, 21).Во согласност со оваа опсервација, неколку клучни резидуи на активни локации во псевдокиназата SelO од Pseudomonas syringae може да се состават со неодамна објавениот суперкомплекс SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Конзервираните остатоци од коронавирус NiRAN надредени во електронската микроструктура.Рекомбинантен протеин (17).Се шпекулира дека документираната (само) U/GMPylation ќе произведе минлива состојба за пренос на NMP на (моментално непознатиот) супстрат (16), а структурната сличност помеѓу NiRAN и протеин киназа (17, 19) е хипотезата дека Ниран модифицира други протеини.
Многу карактеристики, вклучително и неговата единствена и единствена систематска поврзаност со вгнездени вируси и генетско одвојување од RdRp, го прават NiRAN разумен клучен регулаторен ензим за вгнездени вируси, што е од клучно значење за нивното појавување и идентитет.Претходно беа повикани три можни функции кои вклучуваат NiRAN за регулирање на геномот/субгеномскиот превод или репликација/транскрипција.Кога се земаат предвид ретките и нецелосни податоци достапни во тоа време, секоја функција има свои предности и недостатоци (16).Во ова истражување, имаме за цел да ги комбинираме биохемиските и обратните генетски студии на коронавирусите што ги претставуваат двата рода и да ги ставиме нашите наоди во еволутивната позадина на природната мутација на семејството на коронавирус, за да добиеме увид во ова Мистериозно царство.Пријавуваме голем напредок во разбирањето на NiRAN преку идентификација на природни цели во RTC, што (меѓу трите достапни хипотези) придонесува за улогата на овој домен во иницирањето на синтезата на вгнездена вирусна РНК.Ова истражување исто така отвора можности за други улоги на NiRAN на интерфејсот на домаќинот на вирусот.
Со цел да се карактеризираат ензимските својства на доменот NiRAN поврзан со корона вирусот nsp12, произведовме рекомбинантна форма на човечки коронавирус 229E (HCoV-229E) nsp12 во E. coli, со ознака His6 на C-крајот, и го комбиниравме протеин со [α32-P] Инкубирајте заедно со NTP во присуство на MnCl2 како што е опишано во Материјали и методи.Анализата на производот од реакцијата покажа присуство на радиоозначен протеин кој ко-мигрира со nsp12 (106 kDa), што покажува дека коронавирусот nsp12 го катализира формирањето на ковалентни протеин-NMP адукти, преференцијално формирани со уридин монофосфат (UMP) (Слика 1A) и Б).Квантитативната анализа покажа дека во споредба со другите нуклеотиди, интензитетот на сигналот на инкорпорацијата на UMP се зголемил за 2 до 3 пати (слика 1C).Овие податоци се конзистентни со предвидената активност на NMP трансфераза на доменот NiRAN на коронавирусот (16), но укажуваат на тоа дека нуклеотидните преференции на доменот NiRAN на коронавирусот и артерискиот вирус се различни.
Активност на само-НМПилација на HCoV-229E nsp12.(А) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) беше инкубиран со назначениот [α-32P] NTP во присуство на 6 mM MnCl2 за 30 минути (видете Материјали и методи за детали).Реакционите производи беа одвоени со SDS-PAGE и обоени со Coomassie брилијантно сино.(Б) Радио означениот протеин се визуелизира со сликање со фосфор.Позициите на nsp12-His6 и протеинските маркери за молекуларна маса (во килодалтони) се прикажани во A и B. (C) Интензитетот на радиоактивниот сигнал (средна вредност ± SEM) е одреден од три независни експерименти.*P≤0,05.Јачината на сигналот (процент) е поврзана со UTP.
Иако се покажа дека ензимските активности поврзани со NiRAN се од суштинско значење за репликацијата на EAV и SARS-CoV во клеточна култура (16), специфичната функција на NiRAN и потенцијалните цели сè уште не се утврдени.Неодамна објавената структурна сличност помеѓу NiRAN и фамилија на протеини со набори слични на протеин киназа (17, 22) нè поттикна да ја тестираме хипотезата дека NiRAN ја катализира NMPylation на други протеини.Генериравме збир на потенцијални хомологни цели, вклучувајќи неструктурни протеини кодирани од HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), секој од нив содржи ознака на C-терминалот His6 (Си додаток, Табела S1), и инкубирајте ги овие протеини со [α32-P] уридин трифосфат ([α32-P]UTP) во присуство или отсуство на nsp12.Говедскиот серумски албумин и MBP-LacZα фузиониот протеин произведен во E. coli служеа како контроли (Слика 2А, патеки од 1 до 7).Радиоозначениот протеин беше анализиран со натриум додецил сулфат-полиакриламид гел електрофореза (SDS-PAGE) и авторрадиографија и беше откриено дека има силен радиоактивен сигнал во реакцијата која содржи nsp12 и nsp9.Позицијата на сигналот одговара на молекуларната маса на nsp9, што укажува на nsp12-посредувана UMPylation на nsp9 (Слика 2B, патека 7).Ниту еден друг тест протеин не беше пронајден да биде UMPylated, што нè наведе да заклучиме дека nsp9 е специфичен супстрат на nsp12.Во согласност со податоците за само-НМПилација прикажани на слика 1, nsp12 може да ги пренесе сите четири NMP на nsp9, иако ефикасноста е различна, UMP> аденозин монофосфат (AMP)> гванозин монофосфат (GMP)> цитидин монофосфат (CMP)) Слика).3 А и Б).Под условите користени во оваа анализа (скратување на реакцијата и времето на изложување, намалување на концентрацијата на nsp12; материјали и методи), само-NMPилацијата на nsp12 не може да се открие (спореди Слика 2B, лента 7 и слика 1B), што се покажа како ефикасен (И повеќе кругови) UMP се пресели од nsp12 во nsp9.Активноста на UMP трансферазата бара присуство на Mn2+ јони, како што е прикажано на Слика 3C, додека само минимална активност на UMP трансфераза е забележана во присуство на Mg2+ и нема активност во присуство на другите два тестирани двовалентни катјони.Слични податоци се добиени во анализите на NMPylation кои содржат цитидин трифосфат (CTP), гванозин трифосфат (GTP) и аденозин трифосфат (ATP) (SI додаток, слика S1).
HCoV-229E nsp12-посредувана UMPylation на nsp9.Серија протеински супстрати (вклучувајќи го говедскиот серумски албумин, MBP-lacZα и серија HCoV-229E nsps означени со C-терминалот His6 кодиран со ORF1a) беа користени за да се оцени активноста на UMPylation на HCoV-229E nsp12-His6⁺-посредувана протеини.Инкубирајте го протеинот со [α-32P] UTP 10 минути во отсуство (A) или присуство (B) на nsp12 како што е опишано во материјалите и методите.На врвот на А и Б е прикажан SDS-полиакриламид гел обоен со Coomassie Brilliant Blue, а на дното на А и Б се прикажани соодветните авторадиограми.Позицијата на протеинскиот маркер за молекуларна маса (во килодалтони) е дадена лево.Позицијата на nsp12-His6 (B, горе) и радиоактивниот сигнал забележан за време на инкубацијата на nsp12-His6 со nsp9-His6 (B, лента 7) се исто така означени, што покажува дека [α-32P]UMP до nsp9-His6 (12,9 kDa), што не беше забележано за други тестирани протеини.
HCoV-229E NiRAN-посредувана биохемиска и вирусолошка карактеризација на nsp9 NMPylation.(А и Б) Улогата на нуклеотидниот ко-супстрат што се користи во реакцијата.Nsp12-His6 и nsp9-His6 се мешаат и инкубираат во присуство на различни [α-32P] NTP во стандардната NMPylation анализа.(А, горе) nsp9-His6 обоено со Coomassie, одвоено со SDS-PAGE.(А, долу) Авторадиографија на истата област на гелот.(Б) Релативната активност (средна вредност ± SEM) во присуство на назначениот нуклеотиден кофактор е одредена од три независни експерименти.*P≤0,05.(В) Улогата на металните јони.Прикажан е стандардниот тест за NMPylation во присуство на [α-32P] UTP и различни метални јони, секој со концентрација од 1 mM.Во C, горниот, Coomassie обоен nsp9-His6 е прикажан, а во C, долниот, е прикажана соодветната авторадиографија.Големината на означениот протеин (во килодалтони) е прикажана лево од A и C. (D) Мутантната форма на HCoV-229E nsp12-His6 што ја носи наведената замена на аминокиселина е во [α-32P]UTP, како што е опишано во Материјали и методи.Радиоозначениот nsp9-His6 произведен во реакцијата на НМПилација е откриен со сликање со фосфорилација (D, горе).Релативната активност во споредба со протеинот од див тип (wt) е прикажана во D, а дното е земено како просечна (±SEM) од три независни експерименти.Ѕвездичките укажуваат на замена на неконзервирани остатоци.(Д) Титарот на вирусот во супернатантот на културата на p1 клетките добиен 24 часа по инфекцијата беше одреден со анализа на плакета.Замените на кодонот во доменот NiRAN на инженерскиот мутант HCoV-229E се индицирани (нумерирањето на остатоците се заснова на нивната позиција во pp1ab).Како контрола се користеше мутантот на активното место RdRp со недостаток на репликација nsp12_DD4823/4AA.
Со цел да стекнеме подлабоко разбирање за активното место на NiRAN и да ги одредиме остатоците поврзани со активноста на nsp9-специфичната NMP трансфераза, извршивме анализа на мутација, во која ги заменивме конзервативните остатоци во мотивите NiRAN AN, BN и CN ( 16) Тоа е Ala (СИ додаток, слика S2).Дополнително, влијанието на конзервативните замени Arg-to-Lys или Lys-to-Arg беше оценето во два случаи.Како (негативна) контрола, остатоците кои не се или помалку зачувани во доменот NiRAN на коронавируси и други вгнездени вируси се заменуваат со Ala. Заменувајќи го K4116A (во мотив preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (мотив BN) и D4280A (CN) значително ја намалуваат, па дури и ја елиминираат nsp9 NMPylation преку nsp12, додека протеините со конзервативни замени (R4178K), K4116R) задржуваат 60% и 80% од нивната активност, што укажува дека релаксирањето на ограничувањата на нивната соодветна страна синџирите се физичко-хемиски чувствителни (Слика 3Д).Замената на неколку други зачувани остатоци E4145A, D4273A, F4281A и D4283A е многу помалку штетна, а nsp9 UMPylation е само умерено намалена.Слични резултати беа добиени во реакциите на nsp9 NMPylation кои вклучуваат други NTPs (слика 3D и SI додаток, слика S3), потврдувајќи дека набљудуваните ефекти врз специфичните замени на амино киселини се независни од типот на употребениот нуклеотиден ко-супстрат.Следно, го тестиравме можното влијание на овие замени nsp12 врз репликацијата на коронавирусот во клеточната култура.За таа цел, користевме соодветни генетски инженерски комплементарни шаблони за ДНК (cDNA) клонирани во рекомбинантен вирус на вакцинија (23, 24) за транскрипција на 5-7 клетки.Титрацијата на потомството на инфективни вируси произведени во овие клетки покажа дека повеќето HCoV-229E NiRAN мутанти не се изводливи (Слика 3E).Група на неодржливи вирусни мутанти вклучува алтернативи за кои е докажано дека ја елиминираат или значително ја намалуваат активноста на NMP трансферазата ин витро (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), но има две други алтернативи (K4116R, E4814A) % резервирани?Нивната ин витро активност на NMPylation сугерира дека се вклучени дополнителни ограничувања.Слично на тоа, две други мутации (R4178K, F4281A) кои предизвикаа умерено намалување на активноста на NiRAN in vitro NMPylation произведоа живи вируси, меѓутоа, овие вируси значително ги намалија титрите преку репликација.Во согласност со податоците за ин витро активност прикажани на слика 3D, заменувајќи ги четирите други остатоци кои не се зачувани во коронавирус и/или други вгнездени вируси (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) произведени одржливи вируси. умерено намален титар во споредба со вирусот од див тип (Слика 3Д).
Со цел да се проучи дали активноста на NMP трансфераза посредувана од NiRAN зависи од активниот домен RdRp, двата конзервирани Asp остатоци вклучени во координацијата на двовалентни метални јони (11) во RdRp мотивот C беа заменети со Ala. неговата nsp9 NMPylation активност, што покажува дека nsp12-посредуваната in vitro nsp9 NMPylation активност не бара полимеразна активност (SI Додаток, Слика S4).
По воспоставувањето на nsp9-специфичната NMP трансфераза активност за nsp12, се обидовме да го карактеризираме аддуктот NMP-nsp9 со масена спектрометрија (MS).Целосниот протеински масен спектар на рекомбинантниот HCoV-229E nsp9 покажа врв на 12.045 Da (Слика 4А).Додавањето на nsp12 не го промени квалитетот на nsp9, што покажува дека nsp12 и nsp9 нема да формираат стабилен комплекс под употребените услови (денатурација) (Слика 4А).Во присуство на UTP и GTP, мерењето на масата на реакцијата што содржи nsp9 и nsp12 соодветно покажа дека протеинската маса на UTP се помести за 306 Da, а протеинската маса на GTP се помести за 345 Da, што покажува дека секоја nsp9 молекула врзува UMP или GMP (Слика 4) В и Г).Се шпекулира дека енергијата потребна за NiRAN-посредувана nsp9 NMPylation доаѓа од NTP хидролиза и ослободување на пирофосфат.Иако во оваа реакција се користеше 10-кратен моларен вишок на nsp9 (цел) од nsp12 (ензим), беше забележана речиси целосна NMPилација на nsp9, што покажува дека интеракцијата помеѓу nsp12 и nsp9 е краткотрајна, а nsp12 може да NMPylate повеќе nsp9 ин витро молекула.
Единечна NMPилација на nsp9 во присуство на nsp12 и UTP или GTP.Прикажан е деконволвиран целосен протеински масен спектар на HCoV-229E nsp9 (СИ додаток, Табела S1) (АД).(А) само nsp9, (Б) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 во присуство на UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 во присуство на GTP.
За да се одредат остатоците од nsp9 UMPилирани со nsp12, nsp9-UMP беше расцепен со трипсин.Добиените пептиди беа одвоени со нано-високи перформанси течна хроматографија (HPLC) и анализирани со тандем масена спектрометрија (MS/MS) онлајн.Анализата на податоците со помош на софтверскиот пакет Byonic (Protein Metrics) покажа УМПилација на N-терминалната амино киселина.Ова се потврдува рачно.Тандемскиот масен спектар на претходникот пептид [UMP]NNEIMPGK (Си додаток, слика S5A) откри фрагмент на 421 m/z, што покажува дека UMP се врзува за остаток 1 од nsp9.
На N-крајот на nsp9, Asn е зачуван меѓу членовите на Orthocoronavirinae (SI додаток, слика S6).Иако веруваме дека N-терминалниот примарен амин азот е најверојатниот акцептор за UMP, решивме да добиеме дополнителни докази за врзување на NMP на N-терминалот.Поради оваа причина, не-NMPylated и NMPylated N-терминален пептид nsp9 прочистен со HPLC беше изведен во присуство на ацетон и натриум цијаноборохидрид.Под овие услови, само слободните примарни амини може да се модифицираат со пропил (25).N-терминалниот пептид добиен од nsp9 со секвенцата NNEIMPGK содржи два примарни амини, еден на N-крајот на Asn и другиот на страничниот ланец на Lys на C-крајот.Затоа, на двата краја може да се воведат пропил групи.Извлечените јонски хроматограми на не-NMPилирани пептиди се прикажани во додатокот SI, Слика S5B.Како што се очекуваше, може да се идентификуваат N-терминални и C-терминални (моно)пропилирани (SI додаток, слика S5B, горната лента) и дипропилирани пептиди (SI додаток, слика S5B, долна лента).Овој модел се менува со употребата на NMPилираниот N-терминален пептид на nsp9.Во овој случај, може да се идентификуваат само C-терминалните пропилирани пептиди, но N-терминалните пропилирани пептиди и дипропилираните пептиди не се идентификувани (SI Додаток, слика S5C), што покажува дека UMP е префрлен во N-терминалниот примарен амин За да се спречи ова група од правење промени.
Следно, ги заменуваме (со Ala или Ser) или ги бришеме зачуваните остатоци на N-крајот на nsp9 за да ги дефинираме ограничувањата специфични за целта.Врз основа на нашите податоци од MS кои покажуваат дека NiRAN формира nsp9-NMP адукт со примарниот амин на N-терминалниот остаток на nsp9, претпоставивме дека nsp9 NMPylation бара вирусната мастер протеаза (Mpro, nsp5) да го ослободи nsp9 N-терминалот од неговиот полипротеински прекурсор.За да ја тестираме оваа хипотеза, произведовме прекурсорски протеин nsp7-11 кој содржи nsp9 во E. coli и извршивме стандарден тест за NMPylation во присуство на [α-32P] UTP (материјали и методи).Како што е прикажано на Слика 5А (лента 3), несечениот nsp7-11 прекурсор не е радиоозначен со nsp12.Спротивно на тоа, ако nsp7-11 се расцепи со рекомбинантен nsp5 за да се ослободи nsp9 (и други nsps) од прекурсорот, се открива радиоозначен протеин кој мигрира со nsp9, потврдувајќи го нашиот заклучок дека NiRAN и N-селективно формирање на ковалентни nsp9-NMP адукти .Терминалниот примарен амин на N-терминалниот Asn (позиција 3825 во pp1a/pp1ab).Овој заклучок е поддржан и со експерименти со употреба на конструкцијата nsp9, која содржи еден или два дополнителни остатоци на N-крајот.Во двата случаи, УМПилацијата на nsp9 со посредство на NiRAN беше укината (СИ Додаток, Слика S7).Следно, произведовме протеин со еден или два Asn остатоци избришани од 3825-NNEIMPK-3832 пептидната секвенца на N-терминалот на nsp9.Во двата случаи, nsp9 UMPylation беше целосно блокирана (Слика 5Б), обезбедувајќи дополнителен доказ дека вистинскиот nsp9 N-крајник делува како NMP рецептор.
Протеолитичката обработка на nsp9 и улогата на N-терминалните остатоци во nsp12-посредуваната UMPylation.(А) nsp9 UMPylation бара слободен nsp9 N-терминал.Nsp7-11-His6 е претходно инкубиран на 30 °C во пуфер за детекција на NMPylation што содржи UTP во присуство или отсуство на рекомбинантен Mpro (nsp5-His6).По 3 часа, започнете со NMPylation анализата со додавање на nsp12-His6 како што е опишано во Материјали и методи.Реакцијата која содржи nsp5-His6 (лента 1) и nsp9-His6 (лента 2) беше искористена како контрола.По 10 минути, реакцијата беше прекината и реакционата смеса беше одвоена со SDS-PAGE.Протеинот беше обоен со Coomassie Brilliant Blue (А, врв).На десната страна се прикажани прекурсорот Nsp7-11-His6 и преработениот производ што произлегува од расцепувањето посредувано од nsp5-His6.Ве молиме имајте предвид (поради нивната мала големина) дека nsp7 и nsp11-His6 не се откриваат во овој гел, а реакцијата е дополнета со nsp5-His6 (ленти 1 и 4; позицијата на nsp5-His6 е означена со цврст круг) или nsp9-His6 (лента 2) содржи мала количина MBP (означена со отворени кругови) како преостанати нечистотии бидејќи тие се изразени како MBP фузиони протеини (SI додаток, Табела S1).(Б) На Nsp9-His6 варијантата и недостасуваат еден или два N-терминални Asn остатоци (нумерирање на остатоци според позицијата во pp1a/pp1ab) и се прочистува и инкубира со nsp12-His6 и [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE обоена со Coomassie е прикажана горе, B, соодветниот авторадиограф е прикажан на дното.Позицијата на маркерот за молекуларна тежина (во килодалтони) е прикажана лево.(C) Конзервираните остатоци од N-терминалниот HCoV-229E nsp9-His6 беа заменети со Ala или Ser, а истата количина на протеин беше искористена во реакцијата на UMPylation со посредство на nsp12-His6.Производите на реакцијата беа одвоени со SDS-PAGE и обоени со Coomassie Brilliant Blue (C, горе), а радиоозначениот nsp9-His6 беше откриен со сликање со фосфоресценција (C, средно).Користејќи протеин од див тип (wt) како референца (поставено на 100%), релативната активност на NMPylation (средна вредност ± SEM) беше пресметана од три независни експерименти.(Д) Титрите на вирусот во супернатантот на p1 клеточната култура на Huh-7 клетките инфицирани со HCoV-229E од див тип Huh-7 клетки и мутантите што носат назначени замени на аминокиселини во nsp9 беа одредени со анализа на плакета.Како негативна контрола се користеше мотивот со недостаток на репликација RdRp C двоен мутант DD4823/4AA.
N-крајот на nsp9 (особено позициите 1, 2, 3 и 6) е многу зачуван меѓу членовите на подфамилијата Orthocoronavirinae (додаток SI, Слика S6).Со цел да се проучи можната улога на овие остатоци во nsp12-посредувана nsp9 NMPylation, два последователни Asn остатоци на N-крајот на nsp9 беа заменети со Ala или Ser (само или во комбинација).Во споредба со nsp9 од див тип, заменувањето на N3825 со Ala или Ser резултираше со повеќе од двојно намалување на UMPylation со посредство на nsp12 (Слика 5C).Во согласност со нашиот заклучок дека NMPylation се јавува кај N-терминалниот примарен амин наместо страничниот ланец на N-терминалниот остаток, забележавме значителна резидуална NMPylation со замена на N3825A и N3825S.Интересно, ако вториот Asn се замени со Ala или Ser, nsp9 UMPylation се намалува посилно (повеќе од 10 пати), додека замената на Ala на позициите 3, 4 и 6 има само умерен ефект врз nsp9 UMPylation (Слика 2 ) .5C).Слични резултати се добиени со користење на ATP, CTP или GTP (СИ додаток, слика S8).Колективно, овие податоци укажуваат на клучната улога на N2826 (позиција 2 во nsp9) во nsp9 NMPylation.
Со цел да се добие дополнителен доказ за функционалната корелација помеѓу N-крајот на nsp9 и NMPylation, извршивме порамнување на повеќекратна секвенца (MSA) на секвенцата nsp9 од семејството на коронавирус (која варира помеѓу 104 и 113 остатоци) (SI Додаток, Слика S6).Севкупно, во 47 (познати и наводни) видови од 5 родови од подфамилијата Orthocoronavirinae кои инфицираат различни цицачи, птици и домаќини на рептили, само 8 остатоци се вкупно непроменливи.Најобемните промени, вклучувајќи бришења и вметнувања, беа забележани во циклусите помеѓу секундарните структурни елементи на nsp9, како што е утврдено со претходни структурни студии (26 ??28).Беа пронајдени пет непроменливи остатоци во β-спиралата и α спиралата на C-терминалниот дел од nsp9.Три непроменливи остатоци го сочинуваат NNE мотивот на N-крајот на nsp9.Откриено е дека вториот Asn од овој мотив е единствениот непроменлив остаток, кој го дели и хипотетичкиот nsp9 на далечно сродниот коронавирус на жаби и го претставува видот Microhyla letovirus 1 во подфамилијата Letovirinae на Алфалетовирусот.Зачувувањето на остатоците во елементите на секундарната структура на nsp9 може да се рационализира со структурни размислувања за да се одржат преклопните или познатите својства на врзување на РНК.Сепак, се чини дека ова размислување не се однесува на зачувувањето на NNE, и пред оваа студија, природата на ограничувањата што ја ограничуваат варијацијата на трипептидната низа беше целосно прикриена.
Со цел да се утврди важноста на nsp9-NMPylation и NNE конзервација во репликацијата на коронавирусот, произведовме HCoV-229E мутанти, кои носат единечни или двојни замени на nsp9 N-терминалните остатоци, што покажува дека nsp9 NMPylation е штетна in vitro.Пред да започнеме, се обидуваме да одговориме на прашањето дали овие замени (во близина на местото на расцепување nsp8|9) влијаат на протеолитичката обработка на C-терминалниот pp1a регионот.Збир на nsp7-11 полипротеински конструкции кои содржат соодветни замени на N-крајот на nsp9 беа произведени во E. coli и исечени со рекомбинантен Mpro.Протеолитичкото расцепување на четирите места (вклучувајќи го и nsp9 страничното место) не е значително засегнато од воведените замени (Си додаток, слика S9), со исклучок на структурните промени во овие протеини кои се мешаат со расцепувањето nsp8|9 посредувано од Mpro (Или друго) веб-страница.
Huh-7 клетките беа трансфектирани со HCoV-229E РНК со должина на геномот, кодирајќи замена на Ala или Ser во конзервираните NNE трипептиди (N3825, N3826 и E3827) на nsp9 N завршетокот, што покажува дека повеќето од мутациите се фатални.Можевме да го спасиме вирусот со замена на Ser или Ala на N-терминалот Asn (N2835A или N2835S), но не успеавме да го вратиме вирусот со други единечни и двојни мутации во секвенцата NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Слика 5D).
Овие резултати покажуваат дека репликацијата на коронавирусот во ткивната култура е ограничена (иста или слична), ограничувајќи ја природната мутација на местата на nsp9 NMPylation во телото и поддржувајќи ја клучната улога на овој одговор во животниот циклус на коронавирусот.
Во последниот сет на експерименти, го произведовме C-терминалниот His6 означен SARS-CoV-2 nsp12 и nsp9 и две мутантни форми на nsp12 во E. coli.Остатоците од активното место во домените NiRAN и RdRp беа соодветно Користете Ala (слика 6A и SI додаток, Табела S2).K4465 во SARS-CoV-2 nsp12 одговара на K4135 во HCoV-229E (Прилог SI, слика S2), кој се покажа како потребен за активноста на NiRAN и репликација на HCoV-229E (слика 3D и E).Овој остаток, исто така, кореспондира со остаток од артерискиот вирус EAV nsp9 K94, кој претходно се покажа дека е неопходен за NiRAN само-UMPylation/self-GMPylation (16).Како што е прикажано на Слика 6Б, SARS-CoV-2 nsp12 има активност на UMP трансфераза користејќи nsp9 како супстрат, додека мутантот на активното место nsp12_K4465A е неактивен.Двојната замена во SDD карактеристичната секвенца на RdRp мотивот C не влијае на активноста на UMP трансферазата (слика 6Б), што покажува дека активноста на RdRp нема директен ефект во nsp9 UMPylation.Слични податоци се добиени со користење на CTP, GTP и ATP (СИ додаток, слика S10).Накратко, овие податоци покажуваат дека nsp9 NMPylation со посредство на NiRAN има конзервативна активност кај коронавируси кои претставуваат различни родови од подфамилијата на ортокоронавирус.
НМПилација на nsp9 со посредство на SARS-CoV-2 nsp12.(А) СДС-полиакриламид гел обоен со Coomassie кој го покажува рекомбинантниот протеин користен во тестот за NMPylation.Како контрола, користен е мутантен протеин со замена на активна локација во доменот NiRAN (K4465A) и RdRp доменот (DD5152/3AA) на SARS-CoV-2 nsp12.Нумерирањето на остатоците се заснова на позицијата во pp1ab.(Б) Авторадиографија на детекција на UMPylation користејќи nsp9-His6 и [α-32P]UTP како супстрат на nsp12-His6 (див тип [wt] и мутант).Молекуларната маса (во килодалтони) на означениот протеин е прикажана лево.
Домените на NiRAN генерално се конзервирани во Nidovirales (16), што покажува дека тие ги катализираат ензимските реакции суштински за репликација на Нидовирусот.Во оваа студија, можевме да докажеме дека доменот NiRAN на коронавирусот го пренесува NMP (генериран од NTP) на nsp9, мистериозен протеин што врзува РНК вклучен во репликацијата на вирусот (26 ?? 29 ), за да го одреди како природна цел и партнер на коронавирусот RTC.
Доменот NiRAN споделува три мотиви на секвенца (AN, BN и CN), кои содржат многу мал број на остатоци кои се конзервирани во сите семејства во монофилетичниот, но високо диференциран Nidovirales ред (8, 16).Неодамнешните студии покажаа дека тие се структурно поврзани со главно некарактеризирана фамилија на протеини слични на протеин киназа, кои првично беа наречени SelO семејство (17, 19, 22, 30, 31).Протеините поврзани со SelO имаат киназни набори, но немаат неколку конзервирани активни локалитети во класичните кинази (22, 32).Врз основа на обратната ориентација на молекулите на АТП врзани за активното место и стабилизирани со специфични интеракции, се претпоставуваше дека SelO и последователно е потврдено дека пренесува AMP (наместо фосфат) на протеинскиот супстрат (22), додека друг бактериски протеин сличен на SelO YdiU има неодамна се покажа дека го катализира ковалентното прицврстување на UMP за Tyr и неговите остатоци од различни протеински супстрати (33).
Со цел да се потврди и прошири предвидувањето на наводните остатоци од активно место на доменот NiRAN на коронавирус, користевме биохемиски и обратни генетски методи за да извршиме анализа на мутации на коронавирусот nsp12 (слика 3D и додаток E и SI, Слика S3 и табела) S1â S4).Податоците покажуваат дека замената на HCoV-229E K4135, R4178 и D4280 со Ala ја елиминира ин витро активноста на NMP трансферазата и репликацијата на вирусот во клеточна култура (слика 3D и E и SI додатоци, слика S3), поддржувајќи го нивното присуство во NTP γ-фосфат (K4135, R4178) и координација на метални јони на активно место (D4280).Замената E4145A на конзервираната Glu во опсегот на вирусот на птичјото гнездо, предвидена да ја стабилизира позицијата K4135 (17) се покажа дека ја елиминира вирусната репликација, но изненадувачки, активноста беше задржана во in vitro анализата NMPylation (Слика 3D и E и SI додаток, слика S3 и табели S1-S4).Слична опсервација беше направена кога соодветната замена беше воведена во хомологот YdiU на Salmonella typhimurium (E130A) (33).Земени заедно, овие податоци ја поддржуваат регулаторната функција на овој зачуван остаток наместо каталитичката функција.
Замената на конзервираниот остаток на Phe (F4281A) во опсегот на нестовирусот во доменот HCoV-229E NiRAN (8) резултираше со намалување на активноста на NMPylation in vitro и значително намалување на репликацијата на вирусот во клеточната култура (Слика 3D, E и SI) додаток, Слика S3).Податоците се во согласност со важната регулаторна функција на овој остаток, како што е хомологниот DFG мотив Phe остаток прикажан претходно.Во класичните протеински кинази, тој е дел од јамката за врзување Mg2+ и помага да се склопи и регулира 'рбетот???Потребни за ефективна каталитичка активност (32, 34).Замената на Ala и Arg за остатоците K4116 (во мотивот preAN), соодветно, ја елиминира вирусната репликација и, како што се очекуваше, имаше различни ефекти врз активноста на NMP трансферазата in vitro, во зависност од воведениот страничен синџир на аминокиселини (слика 3D и E и SI додатоци , Слика S3).Функционалните податоци се во согласност со структурните информации, што укажува дека овој остаток воспоставил интеракција со АТП фосфатот (17).Во доменот NiRAN на други вгнездени вирусни семејства, позицијата на HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 е окупирана од Lys, Arg или His (8), што покажува дека функционалното ограничување на овој специфичен остаток е опуштено.Замената на D4188A и D4283A ја елиминира или силно ја намалува ензимската активност и ја елиминира репликацијата на вирусот (Слика 3).Овие два остатоци се зачувани во повеќето (но не сите) вгнездени вируси (8), што укажува на важна специфична за семејството, но веројатно некаталитичка функција.Ала замените на неколку други Lys и Asp остатоци (K4113A, D4180A, D4197A и D4273A) кои не се конзервирани во Coronaviridae или други семејства Nestioviridae (8) беа користени како контроли.Како што се очекуваше, овие замени се во голема мера толерантни, со мало намалување на ензимската активност и вирусна репликација во некои случаи (Слика 3 и SI додаток, Слика S3).Севкупно, податоците за мутагенезата на коронавирус се многу конзистентни со податоците за само-GMP и обратна генетика на EAV NiRAN-RdRp (16), во кои EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) има остаток K94 (што одговара на HCoV-229E K4135) важни функции), R124 (што одговара на R4178), D132 (што одговара на D4188), D165 (што одговара на D4280), F166 (што одговара на F4281).Дополнително, податоците за мутагенезата на HCoV-229E се конзистентни и проширени од претходно пријавените податоци за обратна генетика на SARS-CoV (16), исто толку слични на оние забележани за соодветниот CN мотив Phe-to-Ala мутант SARS-CoV_nsp12 опишан фенотип -F219A и HCoV-229E_F4281A (слика 3 D и E и SI додаток, Слика S3 и Табела S1-S4).
Во споредба со EAV ортолози (16), кои имаат јасна предност за UTP и GTP (во реакцијата на само-NMPylation), нашата студија покажува дека доменот NiRAN на коронавирус (претставен со HCoV-229E и SARS-CoV-2) може да биде ефикасен префрлени Сите четири NMPs, иако има мала претпочитаност за UMP (слики 1 и 3).Релативно ниската специфичност на специфичната NTP ко-супстрат е конзистентна со неодамна пријавената SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 суперкомпозитна структура, во која ADP-Mg2+ се врзува за активното место на NiRAN, но не и со аденин дел на формирање на специфични интеракции (17).Во нашата студија, типот на нуклеотид што се користи во реакцијата на NMPylation нема диференцијален ефект врз активноста на мутантниот протеин (SI Додаток, слика S3), што покажува дека ниту еден од овие остатоци не е тесно поврзан со врзувањето на специфична нуклеобаза.Структурната основа и потенцијалното биолошко значење на различните преференции на NTP ко-супстрат забележани во домени NiRAN на коронавируси и артериски вируси останува да се проучуваат;тие може да се вистинити или може да се должат на ограничувањата на нивните соодветни студии.Во моментов, не може да се исклучи дека потенцијалната NMPylator активност на доменот на артерискиот вирус NiRAN (во споредба со претходно карактеризираната активност на само-NMPylation) има поинаква желба за косупстрат, имајќи предвид дека сличноста помеѓу артерискиот и коронавирусот NiRAN доменот е на својата граница.Спореди (16) базирана на низа.Во споредба со псевдокиназата SelO, која користи Mg2+ како кофактор, активноста на коронавирусот и артерискиот вирус NiRAN зависи од Mn2+ (16) (Слика 3C и SI додаток, Слика S1).Зависноста од Mn2+ и очигледната претпочитање за UTP е невообичаена карактеристика на протеинските NMPylators, а неодамна е потврдена во YdiU протеинот на Salmonella typhimurium, кој ја катализира строгата Mn2+-зависна протеинска шаперон UMPylation за да ги заштити клетките од клеточниот ATP базен на индукција на стрес ( 33).
Неодамна опишаната структурна сличност помеѓу доменот на коронавирус NiRAN и клеточните протеински кинази (17, 19) обезбедува дополнителна поддршка за способноста на NiRAN да ковалентно поврзува NMP со други протеини што ги објавивме во оваа студија.Ја фокусиравме нашата потрага по можни цели на NiRAN на протеините кодирани од HCoV-229E ORF1a, за кои е познато дека директно или индиректно помагаат на ORF1b-кодираната реплика на RTC (12, 35).Нашите експерименти обезбедуваат убедливи докази за ефективната и специфична NMPylation на nsp9 (Слика 2).Ако целниот протеин се користи во моларен вишок кој е 8 до 10 пати поголем од оној на ензимот (nsp12), се потврдува дека nsp9 е целосно (моно)NMPизиран (слика 4).Заклучивме дека интеракцијата помеѓу nsp12 и nsp9 е краткотрајна и нема да формира стабилен комплекс со nsp9 (во отсуство на други RTC подединици).Овој заклучок е поддржан од студии за интеракција со протеини на протеомот SARS-CoV (35).MS анализата го идентификуваше примарниот амин на N-терминалниот остаток на nsp9 како место за NMPylation (SI додаток, слика S5).Формирањето на фосфорамидатната врска и N-терминалната амино група ја разликува активноста на НМПилација посредувана од NiRAN од реакцијата на АМПилација посредувана од Pseudomonas syringae SelO, која го катализира формирањето на O-поврзана AMP кај Ser, Thr или Tyr остатоци од пептид. 22), а S. typhimurium YdiU формира O-поврзани (со Tyr) и N-поврзани (со Неговиот) пептид-UMP адукти.Ограничените информации достапни за семејството на протеини SelO укажуваат на тоа дека членовите на оваа голема протеинска фамилија се разликуваат во голема мера во формирањето на адукти на пептид-NMP.Ова е интересна опсервација која заслужува дополнително проучување.
Податоците добиени во оваа студија нè наведоа да претпоставиме дека НМПилацијата на nsp9 бара слободен N-терминал.Во контекст на вирусна репликација, ова ќе биде обезбедено со протеолитичко расцепување на местото за обработка nsp8|nsp9 во репликазниот полипротеин pp1a со посредство на Mpro и pp1ab.Кај повеќето коронавируси, разликата помеѓу оваа специфична локација (VKLQ|NNEI во HCoV-229E) и сите други места на расцепување на коронавирус Mpro е Asn (наместо друг мал остаток, како Ala, Ser или Gly) што го заземаат P1â???Локација (36).Податоците за расцепување на пептидите добиени во раните студии покажаа дека ефикасноста на расцепување на местото nsp8|nsp9 беше пониска од онаа на другите места, што покажува дека 1) оваа специфична локација може да има регулаторна улога во навремено координирана обработка на C-терминалот pp1a регион, или 2) a Улогата на специјалниот конзервиран nsp9 N-крајник во репликацијата на вирусот (37).Нашите податоци (слика 5А) покажаа дека рекомбинантната форма на nsp9 што ја носи вистинската N-терминална секвенца беше ефективно NMPизирана од nsp12.N-терминалната странична секвенца беше отстранета со факторот Xa (nsp9-His6; SI додаток, Табела S1) или Mpro-посредувано расцепување (nsp7-11-His6; Слика 5A и SI додаток, Табела S1).Поважно е тоа што несечениот прекурсор nsp7-11-His6 што содржи nsp9 покажа отпор кон NMPylation на nsp12, што е во согласност со нашите податоци, што покажува дека адуктот nsp9-NMP е формиран преку N-терминалниот примарен амин (SI додаток, Слика S5) .За да стекнеме подлабоко разбирање за специфичноста на подлогата NiRAN, потоа се фокусиравме на соседните N-терминални остатоци на nsp9.Во отсуство на други протеини, тие се структурно флексибилни, спречувајќи ги да бидат откриени во неозначена форма на nsp9 (26 28, 38), што укажува на нивната ограничена природна варијација Ова се должи на важната специфична низа (не поврзана со секундарната структура) функцијата на nsp9 N-терминалниот фрагмент.Ала супституциите на конзервираните остатоци во овој регион (слики 5C и D и SI додаток, слика S8) откриваат дека N3826 е суштински за nsp9 NMPylation in vitro, додека N3825A и E3827A замените доведуваат до намалување на NMPylation, додека M3829A и P38 супституциите не .Очигледно влијае на nsp9 NMPylation.Иако замената на N-терминалниот Asn (N3825A, N3825S) има само умерен ефект врз nsp9 NMPилацијата и репликацијата на вирусот во клеточна култура (слика 5C и D), бришењето на секвенцата на остатоци од Asn од N-терминалниот 3825-NN дипептид Се покажа дека е смртоносно за вирусите, што покажува дека е потребен еден остаток на Asn пред друг остаток на N-крајот, по можност Asn, иако се чини дека замената на слични остатоци може делумно да се толерира (Слика 5Б, Ц и Г).Заклучуваме дека 3825-NN дипептидот, особено конзервираниот и есенцијалниот N3826 остаток во опсегот на коронавирусот (SI додаток, слика S6), обезбедува правилно врзување и ориентација на nsp9 N-крајот во активното место на NiRAN.
Замената на Ala (E3827A) за конзервираната Glu од сите подфамилии, ја задржува nsp9 NMPylation in vitro, но е смртоносна за вирусите во клеточната култура (слика 5C и D), што укажува на дополнителната функција на овој остаток, на пример, во клучните интеракции (NMPилирана или немодифицирана ) nsp9 N-терминал и други фактори вклучени во репликацијата на вирусот.Nsp9 мутациите не влијаеле на протеолитичкиот процес на nsp9 или на кој било соседен nsps (39) (SI Додаток, Слика S9), што покажува дека смртоносните фенотипови на неколку забележани nsp9 мутации не биле предизвикани од дисрегулацијата на областа C протеолитички процес-терминален pp1a .
Горенаведените податоци обезбедуваат докази дека по Mpro-посредуван третман на местото на расцепување nsp8|9 во pp1a/pp1ab, N-крајот на nsp9 може да биде UMPилиран (или делумно изменет со друг NMP).Дополнително, одличната конзервација на N-крајот на nsp9 (вклучувајќи ги и единствените и непроменливите остатоци од Asn во семејството на коронавирус) и обратните генетски податоци добиени во оваа студија (слики 3E и 5D) нè наведоа да заклучиме дека опишаната nsp9 NMPylation е биолошки поврзан и суштински за репликација на коронавирусот.Функционалните последици од оваа модификација остануваат да се проучат, на пример, во врска со претходно опишаната (неспецифична) nsp9 (немодифицирана форма) врзувачка активност на РНК (2628).N-терминалната NMPylation, исто така, може да влијае на интеракцијата на nsp9 со протеински или РНК супстрати или на формирање на различни склопови на четири нивоа.Овие се забележани во структурни студии и потврдено е дека се функционално поврзани со репликацијата на коронавирус, иако особено во отсуство на Во случај на оваа модификација (26- â29, 40).
Иако целната специфичност на доменот NiRAN на коронавирус сè уште треба да се карактеризира подетално, нашите податоци покажуваат дека целната специфичност на протеинот на доменот NiRAN на коронавирус е многу тесна.Иако зачувувањето на клучните активни локалитети (8, 16) во доменот NiRAN на сите семејства на нидовируси силно ја поддржува активноста на конзервираниот NMPylator овие протеини, идентитетот на џебните остатоци за врзување на супстратот од овој домен Зачувувањето и зачувувањето останува да се карактеризираат , и може да се разликуваат помеѓу различни семејства на целите на Nidovirales.Слично на тоа, релевантните цели на другите вгнездени вируси допрва треба да се утврдат.Тие можат да бидат оддалечени ортолози на nsp9 или други протеини, бидејќи секвенците надвор од петте репликазни домени кои генерално се конзервирани во вгнездени вируси се помалку конзервирани (8), вклучувајќи ја и геномната низа помеѓу Mpro и NiRAN, меѓу нив, nsp9 се наоѓа во корона вирус.
Дополнително, во моментов не можеме да ја исклучиме можноста доменот NiRAN да има дополнителни (вклучувајќи мобилни) цели.Во овој случај, вреди да се спомене дека бактериските хомолози во овој појавен протеински NMPylators (NMPylators) (30, 31) се чини дека имаат „главни регулатори“?NMP модулира различни клеточни протеини за да ги регулира или елиминира нивните активности низводно, а со тоа игра улога во различни биолошки процеси, како што се одговорот на клеточниот стрес и редокс хомеостазата (22, 33).
Во оваа студија (слики 2 и 4 и SI додаток, слики S3 и S5), бевме во можност да докажеме дека nsp12 го префрли UMP (NMP) дел на една (конзервирана) позиција во nsp9, додека другите протеини не беа модифицирани во се користи Под условите, поддржана е добро дефинирана (наместо лабава) специфичност на подлогата.Во согласност со ова, во споредба со N-терминалната nsp9 NMPylation, сопствената NMPylation активност на nsp12 е многу мала, нејзиното откривање бара подолго време на експозиција на авторадиографија и се користи 10-кратно зголемување на концентрацијата на nsp12.Дополнително, нашата MS анализа не успеа да обезбеди докази за NMPylation на nsp12, што сугерира дека само-NMPylation на доменот NiRAN е (во најдобар случај) секундарна активност.Сепак, треба да се забележи дека други студии обезбедија прелиминарни докази дека статусот на само-АМПилација на бактерискиот NMPylator може да ја контролира нивната NMPylation активност на други протеински супстрати (22, 33).Затоа, потребни се повеќе истражувања за да се истражат можните функционални ефекти од активностите на само-НМПилација пријавени за EAV nsp9 (16) и коронавирусот nsp12 (оваа студија), вклучувајќи го предложениот ефект сличен на шаперон врз преклопувањето на доменот C-терминален RdRp ( 16)).
Претходно, беа разгледани неколку хипотези во врска со можните функции низводно на нидовирусниот NiRAN домен, вклучително и РНК лигаза, РНК-оградена гуанилат трансфераза и активност на прајминг на протеини (16), но ниту една од нив не е компатибилна со достапните функции низводно.Информациите добиени во следните позиции се точно исто време без да се прават дополнителни претпоставки.Податоците добиени во оваа студија се најконзистентни со (но не можат да докажат) дека доменот NiRAN е вклучен во започнувањето на синтезата на РНК индуцирана од протеини.Претходно се веруваше дека функцијата на доменот NiRAN во 5??²-РНК запирањето или реакциите на лигација на РНК не се засегнати од овие и Поддршката на други податоци.Затоа, на пример, се смета дека активното место на NiRAN го вклучува конзервираниот Asp како општа база (D252 во Pseudomonas syringae SelO; D4271 во HCoV-229E pp1ab; D208 во SARS-CoV-2 nsp12) (SI Додаток , слика 2 ).S2) (17, 22, 33), додека катализата во АТП-зависната РНК лигаза и ензимот за покривање на РНК се врши од страна на ковалентниот ензим-(лизил-N)-NMP посредник, кој вклучува непроменет остаток на Lys ( 41).Дополнително, извонредната специфичност на коронавирусот NiRAN базирана на секвенца за конзервирани протеински цели и релаксираната специфичност за ко-супстрати на NTP (претпочита UTP) се спротивставува на функциите слични на ензимот за покривање со посредство на NiRAN или РНК лигаза.
Очигледно, потребна е многу дополнителна работа за да се потврди и, доколку се докаже, да се елаборира можната улога на nsp9-UMP (nsp9-NMP) во синтезата на РНК индуцирана од протеини, што ќе поврзе неколку интересни, но (досега) извештаи претходно пријавени .Изолирани набљудувања.На пример, утврдено е дека крајот на РНК со негативна нишка на коронавирусот започнува со олиго(U) влакно (42, 43).Оваа опсервација е конзистентна со идејата дека синтезата на РНК со негативна нишка е иницирана со врзување на УМПилираната форма на nsp9 со поли(А) опашката (активатори), што може да биде промовирано со неговото врзување на РНК. Активноста и/или интеракцијата со друг RTC протеин.UMP делот обезбеден од nsp9 потоа може да се користи како „прајмер“ за nsp7/8/nsp12-посредувана олигуридилација, користејќи ја опашката 3??²-поли(А) во геномската РНК или друга секвенца што содржи олиго (А) служи како шаблон, сличен на механизмот воспоставен за пикорнавирусот VPg протеин (44).Што ако предлогот е „ненормативен“????Започнувањето на синтезата на РНК со негативна нишка (индуцирана од протеини) обезбедува врска со набљудувањата, што покажува дека РНК со негативна нишка на коронавирус има UMP (наместо UTP) на својот крај (42), што се смета дека покажува дека нуклеинската киселина Dicer го расцепува крајот фосфорилиран од непозната ендонуклеаза специфична за уридин.Доколку се потврди, оваа хидролитичка активност на нуклеинска киселина може да помогне во ослободувањето на олигомерната UMPилирана форма на nsp9 од 5 ² крајот на зародишната негативна нишка.Можната улога на nsp9 во грундирањето на протеините е исто така конзистентна со претходните студии за обратна генетика, кои покажаа дека nsp9 (и nsp8) комуницираат критички и специфично со конзервираниот РНК елемент кој делува cis во близина на третиот крај на геномот на коронавирусот.45).Според овој извештај, овие претходни набљудувања сега може да се преиспитаат и прошират преку понатамошни истражувања.
Накратко, нашите податоци ја определија специфичната активност на неслободна ознака за ензимски вгнездени вируси поврзани со RdRp на N-крајот.Кај коронавирусот, оваа новооткриена активност UMPylator/NMPylator со посредство на NiRAN се користи за да се потпре на Mn2+ и соседните остатоци од Asn и да предизвика формирање на (нискоенергетски) фосфорамидат врски со N-терминалниот примарен амин.Преку Mpro-посредувано расцепување на местото на расцепување nsp8|9, целта nsp9 може да се користи за NMPylation, што укажува на функционалното спојување помеѓу протеазата и доменот NiRAN, кој се протега до RdRp.Зачувувањето на клучните остатоци во активното место nsp12 NiRAN и целта nsp9, комбинирано со податоците добиени од два коронавируси вклучувајќи го и SARS-CoV-2, обезбедува силен доказ дека nsp9 NMPylation е коронавирус Конзервативните карактеристики се исто така клучен чекор во репликацијата на вирусот.Достапните податоци нè наведуваат да заклучиме дека специфичната улога на НМПилираната форма на nsp9 во синтезата на РНК индуцирана од протеини е разумно сценарио за коронавирус и други вгнездени вируси, а НиРАН може да таргетира и други неидентификувани протеини.Регулирај го вирусот.Интеракција на домаќинот.Доколку се потврди, вклученоста на протеинските прајмери во синтезата на вирусна РНК ќе го зголеми афинитетот на секвенцата на домените Mpro/3CLpro и RdRp помеѓу претходно откриениот коронавирус и супергрупата слична на пикорнавирус (9), кои сега се обединети во неодамна воспоставените пизонивирити ( 46) во категоријата.
Нашите податоци, исто така, покажуваат дека основните, селективни и конзервативни ензимски активности идентификувани во оваа студија може да се користат како цели за антивирусни лекови.Соединенијата кои го попречуваат врзувањето (и последователната модификација) на конзервираниот nsp9 N-терминал во активното место на NiRAN може да се развијат во ефективни и разновидни антивирусни лекови, погодни за третман на животински и човечки коронавирус од инфекции од различен (под)род , вклучувајќи ги САРС-КоВ-2 и Блискоисточниот респираторен синдром Коронавирус.
Кодирачката секвенца на протеинот на коронавирус произведен во оваа студија беше засилена со RT-PCR користејќи РНК изолирана од Huh-7 инфицирана со HCoV-229E или Vero E6 инфицирана со SARS-CoV-2 и вметната со користење на стандардни процедури за клонирање.pMAL-c2 (Нова Англија биолошка лабораторија) или pASK3-Ub-CHis6 (47) експресивен вектор (SI Додаток, табели S1 и S2).Замените на единечните кодон беа воведени со PCR-базирана мутагенеза насочена кон локацијата (48).За да се произведе MBP фузиониот протеин, E. coli TB1 клетките беа трансформирани со соодветна pMAL-c2 плазмидна конструкција (SI додаток, Табела S1).Фузивниот протеин беше прочистен со амилозна афинитетна хроматографија и расцепен со факторот Xa.Последователно, C-терминалниот His6-означен протеин беше прочистен со Ni-имобилизирана метална афинитетна хроматографија (Ni-IMAC) како што беше претходно опишано (49).За да го произведат фузиониот протеин на убиквитин, клетките на E. coli TB1 ја користеа соодветната плазмидна конструкција pASK3-Ub-CHis6 (SI Додаток, табели S1 и S2) и pCGI плазмидна ДНК што кодира специфична за убиквитин Ц-терминална хидролаза 1 (Ubp1).Трансформација (47).Протеинот на коронавирус означен со C-терминалот His6 беше прочистен како што беше претходно опишано (50).
Тестот за само-НМПилација на HCoV-229E nsp12-His6 беше изведен како што е опишано во EAV nsp9 (16).Накратко, nsp12-His6 (0,5 μM) содржи 50 mM 4-(2-хидроксиетил)-1-пиперазинетансулфонска киселина (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM дитиотреитол (DTT), 6 mM MnCl2, 25 μM пуфер наведениот NTP и 0,17 µM се совпаѓаат со [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) на 30 °C за 30 минути.Во сите други (стандардни) анализи на NMPylation на nsp12-посредувана nsp9 NMPylation, условите за реакција се приспособуваат на следниов начин: nsp12-His6 (0,05 μM) и nsp9-His6 (4 μM) во присуство на 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μM означен NTP и 0,17 μM совпаднат [α32-P]NTP.По инкубирање 10 минути на 30°C, примерокот од реакцијата беше измешан со пуфер за примерок SDS-PAGE: 62,5 mM трис(хидроксиметил)аминометан HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% глицерол и 0,0005% сина боја.Протеинот беше денатуриран со загревање на 90 °C за 5 минути и одделен со 12% SDS-PAGE.Гелот е фиксиран и обоен со раствор Coomassie Brilliant Blue (40% метанол, 10% оцетна киселина, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), обезбојуван и изложен на фосфоресцентен екран за снимање 20 часа (за откривање на nsp12 од NMPylation) или (максимум) 2 часа (за да се процени nsp9 NMPylation).За скенирање на екранот се користеше сликар Typhoon 9200 (GE Healthcare), а ImageJ за анализа на интензитетот на сигналот.
За MS анализа, 1 μM nsp12-His6 и 10 μM nsp9 (без хексахистидин ознака) беа користени во анализата на NMPylation (SI додаток, Табела S1) и се користеше зголемената концентрација од 500 μM UTP и GTP.Во зависност од нивната концентрација и очекуваниот квалитет на протеинот, системот за HPLC на Waters ACQUITY H-класа опремен со колона MassPrep (Waters) се користеше за отстранување на сол од 1 до 10 µL од пуферски протеински раствори онлајн.Десолениот протеин се елуира во изворот на електроспреј јони на масен спектрометар Synapt G2Si (Води) преку следниот градиент на пуфер А (вода/0,05% мравја киселина) и пуфер Б (ацетонитрил/0,045% мравја киселина), а температурата на колоната е 60 ° C и брзина на проток од 0,1 mL/min: елуција изократски со 5% A за 2 минути, потоа линеарен градиент до 95% B во рок од 8 минути и одржувајте 95% B уште 4 минути.
Откриени се позитивни јони со масен опсег од 500 до 5000 m/z.Глу-фибринопептидот Б се мери на секои 45 секунди за автоматска корекција на наносот на масата.Користете го софтверот за инструменти MassLynx со екстензија MaxEnt1 за да го раздвоите просечниот спектар по одземање на основната линија и измазнување.
UMPилираниот HCoV-229E nsp9 беше дигестиран со додавање на модифициран трипсин (Serva) со степен на секвенционирање и се инкубираше преку ноќ на 37 °C.Колона за вртење Chromabond C18WP (дел број 730522; Macherey-Nagel) беше искористена за десолтирање и концентрирање на пептидите.Конечно, пептидот беше растворен во 25 µL вода, која содржеше 5% ацетонитрил и 0,1% мравја киселина.
Примероците беа анализирани со MS со помош на масен спектрометар Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Крајниот nanoâ HPLC систем (Dionex), опремен со прилагодено монтирано на крајот 50 cm??Колона од 75 μm C18 RP спакувана со магнетни зрнца од 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Поврзете се со масен спектрометар онлајн преку изворот на наноспреј Proxeon;инјектира 6 µL раствор за дигестија на трипсин во внатрешен дијаметар од 300 µm ×??1 cm C18 PepMap пред-концентрациона колона (Thermo Scientific).Користејќи вода/0,05% мравја киселина како растворувач, примерокот беше автоматски заробен и десалиниран со брзина на проток од 6 µL/min.
Следниве градиенти на вода/0,05% мравја киселина (растворувач А) и 80% ацетонитрил/0,045% мравја киселина (растворувач Б) се користени за да се постигне раздвојување на триптичните пептиди со брзина од 300 nL/min: 4% B за 5 минути, потоа 30 А линеарен градиент до 45% Б во рок од неколку минути и линеарно зголемување до 95% растворувач Б во рок од 5 минути.Поврзете ја хроматографската колона со наноемитер од не'рѓосувачки челик (Proxeon) и испрскајте го елуентот директно до загреаниот капилар на масениот спектрометар користејќи потенцијал од 2.300 V. Скенирањето на испитувањето со резолуција од 60.000 во анализаторот на масата Orbitrap е поврзано со најмалку три податоци MS/MS скенови, динамички исклучени за 30 секунди, користејќи линеарна дисоцијација предизвикана од судир со стапица на јони или дисоцијација на судир со поголема енергија во комбинација со детекција на орбитап, Резолуцијата е 7.500.
Време на објавување: 03.08.2021